NGFN-PLUS

Entwicklung einer Bisulphit-Hochdurchsatz-Sequenzierungsplatform in Kombination mit integrierter Bioinformatik

Leitung:    Prof. Dr. Jörn Walter
Institut: Universität des Saarlandes FR8.3 Biowissenschaften Genetik/Epigenetik
Homepage: www.uni-saarland.de
Die Analyse der Entstehung von Darmkrebs wird häufig durch fehlende Proben aus frühen Tumorstadien erschwert. Das APCMin-Mausmodell bietet die Möglichkeit, Darmkrebs in seiner Entstehung, sprich die adenomatösen Vorläufer, zu verstehen und zu charakterisieren. In Zusammenarbeit mit dem Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik (AG Dr. Bernhard Herrmann) und der Charité (AG Prof. Dr. Christine Sers) in Berlin wurden genomweite genetische wie auch epigenetische Studien durchgeführt. Potentiell relevante regulatorische Genombereiche wurden dann durch lokale Tiefensequenzierung genauer charakterisiert. Dazu wurde eine experimentelle und bioinformatische Pipeline entwickelt, die sowohl technisch erstklassige Resultate als auch statistische, biologisch interpretierbare Datensätze liefert. Durch die parallele Analyse humaner Darmkrebszelllinien sowie primärem Tumormaterial konnten konservierte Methylierungsmarker identifiziert werden, die im Tumor hochmethyliert und im Normalgewebe unmethyliert sind.

In Teilprojekt 4 sollten epigenetische Veränderungen in APCMin-Tumoren durch Tiefensequenzierung präzise erfasst und bioinformatisch zum Gewebe, der Gen-Expression, der Genomstruktur und, falls zugänglich, weiteren epigenetischen Informationen in Relation gesetzt werden. Darauf aufbauend sollten Hypothesen für cis- oder trans- wirkende Modifiereffekte erstellt sowie Kandidaten-Regionen für Adenom-Biomarker bestimmt werden.
Aus genomweiten MeDIP-Seq-Analysen wurden 26 differentiell angereicherte Regionen aus Adenom- und Normalgewebe mittels 454 GS-FLX-Technologie tiefensequenziert (Bi-PROF, Gries et al., 2013). Die Bisulphit-Amplikon-Tiefensequenzierungsdaten wurden mit einem innerhalb der Arbeitsgruppe entwickelten Programm (BiQ Analyzer HT, Lutsik et al., 2011) ausgewertet. Die erzeugten Bisulfit-basierten Daten zeigten eine hohe Korrelation zu vorhandenen MeDIP-Seq-Daten sowie eine hohe inter-individuelle Konsistenz. Charakteristische Präsenz von lokaler DNA-Methylierung fand sich ausschliesslich in Adenomen, was auf die Etablierung von DNA-Methylierung als frühes Ereignis in der Tumorentwicklung direkt nach dem Verlust von APC hindeutet.
Parallel zu APCMin wurden humane Darmkrebstumoren für einige dieser differentiell methylierten Regionen mittels Bi-PROF analysiert. Aus dieser in PLoS Genetics veröffentlichten Arbeit (Grimm et al., 2013) werden zur Zeit potentielle Methylierungsmarker, wie KDM2B und SUSD5, auf primärem Tumormaterial und korrespondierendem Blutplasma getestet.



Abbildung:
Epigenetische Charakterisierung von differentiell methylierten Regionen
A Exemplarische MeDIP-Seq-Anreicherungsprofile im Ushg1-Gen von 5 individuellen Adenomproben (Ad) gegen 3 korrespondierende Proben benachbarten Gewebes (N) und 3 individueller normaler Mucosa-Proben (B).
B Die stark angereicherte Region im Exon 2 des Ushg1-Gens wurde für das Set B3-N5-Ad5 mittels Bi-PROF tiefensequenziert. In den Methylierungsmuster-Diagrammen oben (erstellt mit BiQ Analyzer HT, Lutsik et al. 2011) symbolisieren Zeilen einzelne Sequenzreads, die Spalten stehen für die 29 analysierten CpGs innerhalb der Region. Das Balkendiagramm darunter zeigt eine klar höhere Methylierung für sämtliche CpG-Dinukleotide in der Adenomprobe; aus Grimm et al., 2013 (PLoS Genetics).