Quantitative Analyse von Proteininteraktionen

Leitung:		Dr. Jörg Hoheisel
Institut:		Deutsches Krebsforschungszentrum
Homepage:		www.dkfz.de

Das Hauptziel dieses Teilprojekts ist die quantitative Bestimmung auf gesamtgenomischer Ebene von Proteinwechselwirkungen mit anderen Proteinen und DNA, speziell mit Blick auf den Effekt einer Zugabe von Wirkstoffen. Aufbauend auf einem Prozess zur Herstellung von Protein-Microarrays, der auf einer in situ Transkription und Translation beruht, werden wir Microarrays herstellen, die eine Vielzahl der Genprodukte des Menschen in voller Länge repräsentieren. Auf der Basis dieser Protein-Microarrays werden wir Protein-Protein Interaktionen studieren. Dazu werden auch Dissoziationsanalysen an allen Proteinen des Microarrays gleichzeitig durchführt, um dadurch die Bindungskonstanten zu bestimmen. Eine Anwendung wird die Analyse der Affinität und Spezifität von Antikörpern sein, die für bildgebende Verfahren oder andere Zwecke hergestellt werden. Daneben werden wir Interaktionen mit regulativen Proteinen untersuchen. Ein Schwerpunkt werden die menschlichen Transkriptionsfaktoren sein. Zur Analyse patienten-spezifischer Proteinsequenzen aus individuellen Geweben werden wir die in situ Herstellung von Protein Microarrays mit der Herstellung von PCR-Produkten direkt auf Microarrays kombinieren. Passende Primermoleküle werden in einem Belegpunkt aufgebracht oder in situ synthetisiert. Nach Hybridisierung von RNA bzw. daraus erstellter cDNA wird PCR auf dem Chip durchgeführt. Werden solche Reaktionen mit RNA/cDNA von individuellen Geweben oder Personen durchgeführt, können die entsprechend spezifischen Proteine bereitgestellt werden. Jeder Protein-Microarray repräsentiert so das Proteom eines bestimmten Gewebes oder einer Person und kann zur Charakterisierung dieses individuellen Proteoms genutzt werden. Bei auffälligen Unterschieden können die relevanten DNA-Sequenzen gewonnen und analysiert werden. Diseer Ansatz wird auch für die Analyse der Mausmodelle genutzt werden. Mit Hilfe einer Bibliothek von 55.000 Molekülen, die am DKFZ vorhanden ist, soll der Effekt von bestimmten Wirkstrukturen und –stoffen auf die Proteininteraktion untersucht werden. Schwerpunkt wird wiederum die Analyse von Transkriptionsfaktoren sein.