NGFN-PLUS
Identifikation und Charakterisierung von Modulatoren der Alzheimer-Pathogenese
| Leitung: | Prof. Dr. Erich Wanker | |
| Institut: | Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Berlin-Buch | |
| Homepage: | www.mdc-berlin.de |
Ziel des Teilprojektes war die Identifizierung bislang unbekannter Zusammenhänge zwischen Wirkstoffen, Proteinen und Protein-Netzwerken bei Alzheimer (AD).
Zur Erstellung eines Interaktionsnetzwerks für das krankheitsrelevante Amyloid-Präkursorprotein (APP) und zur Vorhersage potentieller Modulatoren der Produktion und Aggregation des daraus generierten Peptids Amyloid-beta (Aβ) wurde ein genomweiter Yeast-2-Hybrid (Y2H)-Screen mit ca. 14.000 Proteinen und Proteinfragmenten durchgeführt, wobei neun potenzielle Modulatoren identifiziert werden konnten.
In einem weiteren fokussierten Yeast-2-Hybrid-Screening wurden ca. 800 Expressionsplasmide von Genen hergestellt, die laut öffentlichen Datenbanken eine potentielle Rolle bei AD spielen. Auch die neun potenziellen Modulatoren wurden integriert. Es ergaben sich 666 Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) die in AD involviert sind. Die gewonnenen Daten wurden anschließend um öffentlich verfügbare PPI-Daten ergänzt um daraus ein umfassendes Netzwerk mit 20231 PPIs zwischen 6396 direkt oder indirekt mit APP interagierenden Proteinen zu erstellen.
Um Proteine oder Wirkstoffe zu finden, die die Aβ-Aggregation bzw. -Produktion modulieren, haben wir mehrere Zellmodelle etabliert. Dazu wurden Aβ-Aggregate in humane Neuroblastomzellen (SH-SY5Y, SH-EP) und APP-überexprimierende CHO- und HEK293-Zellen eingebracht, sowie ein Aβ-ELISA mit APP-überexprimierenden SH-SY5Y-APP695-Zellen entwickelt. Die Zellmodelle wurden erfolgreich bei der Untersuchung des Einflusses der zwei Wirkstoffe EGCG und O4 auf die Aβ-Aggregation und -Toxizität eingesetzt (Bieschke et al., PNAS, 2010; Bieschke et al., NatChemBiol., 2011).
Basierend auf Daten bekannter Modulatoren der Aβ-Produktion, auf Gen-Expressionsdaten von AD-Patienten und auf umfangreichen Netzwerkanalysen konnten wir 200 potentielle Modulatoren der APP-Prozessierung identifizieren. Knock-Down-Experimente mit 84 der vielversprechendsten Modulatoren ergaben im SH-SY5Y-APP695 AD-Zellmodell 65 Hits, die die extrazellulären Aβ42- und Aβ40-Level signifikant veränderten.
383 Wirkstoffe wurden in SH-EP-Zellen auf ihre pro- oder anti-aggregatorische Wirkung untersucht. Die Quantifizierung der Aβ-Aggregate durch Hochdurchsatz-Mikroskopie zeigte dabei, dass 43 Wirkstoffe die Aggregation signifikant verringerten, während 6 die Aggregatmenge erhöhten. Zwei erfolgversprechende, zu einer Substanzklasse gehörenden Wirkstoffe wurden ausgewählt und zusammen mit 31 weiteren strukturell verwandten Substanzen hinsichtlich ihres Effekts auf die Aβ-Aggregation und -Toxizität systematisch untersucht. Von diesen wurden die zwei interessantesten näher charakterisiert.
Abbildung 1: Aβ-Fibrillen im Rasterkraftmikroskop.
Weitere Teilprojektleiter:
Zur Erstellung eines Interaktionsnetzwerks für das krankheitsrelevante Amyloid-Präkursorprotein (APP) und zur Vorhersage potentieller Modulatoren der Produktion und Aggregation des daraus generierten Peptids Amyloid-beta (Aβ) wurde ein genomweiter Yeast-2-Hybrid (Y2H)-Screen mit ca. 14.000 Proteinen und Proteinfragmenten durchgeführt, wobei neun potenzielle Modulatoren identifiziert werden konnten.
In einem weiteren fokussierten Yeast-2-Hybrid-Screening wurden ca. 800 Expressionsplasmide von Genen hergestellt, die laut öffentlichen Datenbanken eine potentielle Rolle bei AD spielen. Auch die neun potenziellen Modulatoren wurden integriert. Es ergaben sich 666 Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) die in AD involviert sind. Die gewonnenen Daten wurden anschließend um öffentlich verfügbare PPI-Daten ergänzt um daraus ein umfassendes Netzwerk mit 20231 PPIs zwischen 6396 direkt oder indirekt mit APP interagierenden Proteinen zu erstellen.
Um Proteine oder Wirkstoffe zu finden, die die Aβ-Aggregation bzw. -Produktion modulieren, haben wir mehrere Zellmodelle etabliert. Dazu wurden Aβ-Aggregate in humane Neuroblastomzellen (SH-SY5Y, SH-EP) und APP-überexprimierende CHO- und HEK293-Zellen eingebracht, sowie ein Aβ-ELISA mit APP-überexprimierenden SH-SY5Y-APP695-Zellen entwickelt. Die Zellmodelle wurden erfolgreich bei der Untersuchung des Einflusses der zwei Wirkstoffe EGCG und O4 auf die Aβ-Aggregation und -Toxizität eingesetzt (Bieschke et al., PNAS, 2010; Bieschke et al., NatChemBiol., 2011).
Basierend auf Daten bekannter Modulatoren der Aβ-Produktion, auf Gen-Expressionsdaten von AD-Patienten und auf umfangreichen Netzwerkanalysen konnten wir 200 potentielle Modulatoren der APP-Prozessierung identifizieren. Knock-Down-Experimente mit 84 der vielversprechendsten Modulatoren ergaben im SH-SY5Y-APP695 AD-Zellmodell 65 Hits, die die extrazellulären Aβ42- und Aβ40-Level signifikant veränderten.
383 Wirkstoffe wurden in SH-EP-Zellen auf ihre pro- oder anti-aggregatorische Wirkung untersucht. Die Quantifizierung der Aβ-Aggregate durch Hochdurchsatz-Mikroskopie zeigte dabei, dass 43 Wirkstoffe die Aggregation signifikant verringerten, während 6 die Aggregatmenge erhöhten. Zwei erfolgversprechende, zu einer Substanzklasse gehörenden Wirkstoffe wurden ausgewählt und zusammen mit 31 weiteren strukturell verwandten Substanzen hinsichtlich ihres Effekts auf die Aβ-Aggregation und -Toxizität systematisch untersucht. Von diesen wurden die zwei interessantesten näher charakterisiert.
Abbildung 1: Aβ-Fibrillen im Rasterkraftmikroskop.
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