Validierung und Zergliederung der Signalwege von krankheitsrelevanten Genen mit endoribonuklease-präparierter siRNA

Leitung:		Prof. Dr. Frank Buchholz
Institut:		Medizinische Fakultät der TU Dresden, Universitäts Krebszentrum (UCC), Universitätsklinikum Carl Gustav Carus
Homepage:		http://www.buchholzlab.org

Ziel des Projektes war es, funktionale Daten hinsichtlich Protein-Protein-Interaktionen via Funktionsverluststudien zu erzielen. Mit Hilfe der in unserem Labor entwickelten hoch effizienten und spezifischen endoribonuklease präparierten (e)siRNA Ressourcen wurden Knockdowns (Ausschaltungen) von Proteinkandidaten durchgeführt, um Protein-Komplex-Zusammensetzungen zu bestimmen, als auch Proteinlandschaften umfassend zu studieren. Unter dem Einsatz von esiRNA-basierten RNAi-Screens konnten zahlreiche neue krankheitsrelevante Gene identifiziert werden. So konnte ein neuartiger Protein-Komplex, welcher im Zusammenhang mit der Erkrankung Hereditäre Spastische Spinalparalyse (HSP) steht, identifiziert und funktionale Beziehungen zwischen HSP-Erkrankungen und DNA-Reparatur bestimmt werden. Darüber hinaus wurde ein vergleichender RNAi Screen in TP53 positiven und TP53 negativen Zellen erfolgreich durchgeführt. Hierbei wurde u.a. das Gen UNRIP als Vulnerabilität (Verletzlichkeit) von TP53-negativen Krebszellen aufgedeckt. Da TP53 eines der am häufigsten mutierten Gene bei Krebserkrankungen ist, enthüllt diese Entdeckung wohlmöglich eine „Achillesferse“ für viele Krebszellen. Bei weiteren Studien wurden drei Protein-Komplex-Anordnungen via RNAi untersucht, indem transgene BAC-Zelllinien (bakterielle artifizielle chromosomale Zelllinien) für alle Komplex-Komponenten generiert und deren Protein-Level als auch die Lokalisierung von interagierenden Proteinen untersucht wurden. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass sich bei Ausschaltung anderer Komplex-Komponenten die gemessenen Proteinwerte in der Zelle reduzieren und somit eine Instabilität des kompletten Proteinkomplexes hervorgerufen wird. Dieses Resultat wird es höchstwahrscheinlich nicht nur künftig erlauben, globale Protein-Level-Abhängigkeiten zu messen, sondern auch Proteine eines Komplexes gezielt zu regulieren. Ferner wurde HOT1 als neues direkt Telomer-bindendes Protein in Wirbeltieren identifiziert. Mit Depletions- und Überexpressions-Experimenten (Entfernung von Zellsubstanzen bzw. erhöhte Anreicherung) konnte HOT1 als positiver Längenregulator von Telomeren klassifiziert und eine Interaktion mit dem aktiven Telomerase-Komplex nachgewiesen werden. Da Telomerlängen in Abhängigkeit mit dem Zellalterungsprozess und der Entwicklung von Krebs stehen, stellt die nachgewiesene positive funktionale Rolle von HOT1 ein signifikantes therapeutisches Target dar.