NGFN-TRANSFER

Proteinlysat Mikroarray Analyse für uPA und PAI-1 von Formalin-fixierten Brustkrebsgeweben

Leitung:    Prof. Dr. Karl-Friedrich Becker
Institut: Institut für Pathologie der Technischen Universität München
Homepage: www.path.med.tu-muenchen.de/

Teilprojekt  1 der Innovationsallianz „Brustkrebsmarker“ befasste sich mit der quantitativen Bestimmung der Marker uPA und PAI-1 aus Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Geweben zur Therapiefindung von Patientinnen mit nicht metastasiertem Brustkrebs.
Der bisher klinisch zugelassene Test zur Bestimmung von uPA und PAI-1 mittels ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ist nur für Gefriergewebe etabliert. Das ist ein enormes Hindernis für die Verbreitung dieser Methode im klinischen Umfeld, da häufig nur FFPE-Gewebe für solche diagnostischen Tests zur Verfügung steht. In diesem Teilprojekt konnten erfolgreich Verfahren etabliert werden, um uPA und PAI-1 aus FFPE Geweben zu isolieren und mit etablierten Methoden, z.B. Western blot, nachzuweisen. Außerdem gelang die quantitative Bestimmung der beiden Marker mittels sog. Reverse Phase Protein Arrays (RPPA). In einem weiteren Schritt wurde die Reproduzierbarkeit des RPPA zur Analyse von uPA und PAI-1 aus FFPE-Geweben erfolgreich validiert. Mit einem Markerset aus uPA, PAI-1 und 22 assozierten Signalwegsmolekülen wurde eine Signalwegsstudie mit RPPA durchgeführt. Wir haben gefunden, dass die Expression von PAI-1-positiv korreliert ist mit der Expression der Integrin-Untereinheit ?V, uPAR, p-Akt, ER?, EGFR, HER3, HER4 und p-HER2. Für uPA konnte eine statistisch signifikante, positive Korrelation mit ER?, p-Erk und Stat3 nachgewiesen werden.
Die Übertragung des klinisch etablierten ELISA mit Proteinextrakten aus FFPE Geweben erwies sich jedoch als äußerst schwierig. Alle Bestrebungen den zugelassenen ELISA kompatibel mit Proteinextrakten aus FFPE Geweben zu machen, wie z.B. Eliminierung störender Substanzen aus dem Extraktionspuffer, Umpuffern der Proben in einen mit dem ELISA kompatiblen Puffer, Verwendung alternativer Extraktionspuffer, führten nicht zum gewünschten Erfolg. Als Alternative wurden die quantitativen Daten des RPPA mit dem Ergebnis des klinischen ELISA in einer Kohorten Studie verglichen. Dabei kam es jedoch sowohl für uPA (rs = 0,051; p = 0,54) als auch für PAI-1 zu deutlichen Abweichungen zwischen den beiden Methoden. Zwar ergab sich für PAI-1 eine signifikante Korrelation (p < 0,001) jedoch nur mit einem Korrelationskoeffizienten rs = 0,573. Somit kann nicht von einer ausreichenden Übereinstimmung der beiden Methoden gesprochen werden. Der Nachweis von uPA und PAI-1 aus FFPE-Geweben ist zwar mittels RPPA möglich, erfüllt aber aufgrund der vom ELISA unterschiedlichen Resultate nicht die Voraussetzungen für eine routinemäßige Anwendung.

Eine in Paraffinwachs eingebettete Gewebeprobe (© Institut für Pathologie, TU München)