Zelluläre Screeningsysteme

Leitung:		Dr. Ulrich Tschulena
Institut:		DKFZ Heidelberg
Homepage:		www.dkfz.de

Hauptziel dieses Teilprojektes ist es Expertise, Kapazitäten und Technologien zur Verfügung zu stellen, die der Identifizierung and Untersuchung zellulärer Funktionen krankheitsrelevanter Gene und Proteine dienen werden. Funktionelle zelluläre Hochdurchsatz-Assays wurden innerhalb von NGFN-2 etabliert und validiert, und sollen nun durch weitere zu entwickelnde Assays komplementiert werden. Gene und Proteine (~ 1.200), die in NGFN-2 vorselektiert wurden sollen auf durch Überexpression (ORFeome Ressource) und knock-down (RNAi) induzierte phänotypische Veränderungen untersucht werden. Damit soll schließlich eine Gruppe an Kandidatenproteinen identifiziert werden, um das Wissen über die Interaktion von Wachstumsfaktoren, Hormon-gesteuerter Signalwege und die Bedeutung auf Zellzyklus und Medikamentenwirkung zu erweitern. Innerhalb der Functional Profiling-Pipeline der SMP-Cell von NGFN-2 haben die krankheits-orientierten Teilprojekte dieser Kooperation zelluläre Assays entwickelt und validiert, welche in Gen „gain-“ und „loss-of-function“ Screens mittlerer Größe bis hin zu whole-genome Screens angewendet wurden. Die ORFeome- und RNAi- Ressourcen von SMP-Cell wurden dabei verwendet, um neue Proteine zu identifizieren, welche eine Rolle spielen für Zellzyklusregulation, Signaltransduktion oder andere krebsrelevante Prozesse.

Die Mehrheit der entwickelten funktionellen zellulären Assays untersuchen krebsrelevante Prozesse:

Signalwege: Erk1/2- und p38-Assays wurden mittels der Messung des Aktivitäts-/Phosphorylierungs-Status der entsprechenden Kinasen nach einer Perturbation durchgeführt, um Aktivatoren oder Inhibitoren der verschiedenen Signalkaskaden zu identifizieren.

Zellzyklus/Zellproliferation: DNA-Replikations-Assays, messen den Zellzyklus Status durch die Färbung von DNA mit 7-AAD oder bestimmen generelles Zellwachstum (WST-1).

Apoptose: Ein Caspase-3-Assay analysiert den Aktivierungsstatus endogener Caspase-3 als Marker für Apoptoseinduktion.

Zellablösung und Zellinvasion: Zellen im Überstand oder Zellen, welche eine künstliche Basallamina passiert haben, werden quantifiziert, um die durch Perturbationen induzierte phänotypische Modulierung zu messen.

Die genannten Assays wurden entwickelt und auf ihre Reproduzierbarkeit, Signifikanz und die Verwendbarkeit der Ergebnisse validiert.