NGFN-TRANSFER
Aktivierung von neutrophilen Granulocyten durch kleine Plasmaproteine von Uremikern
| Leitung: | Dr. Horst-Dieter Lemke | |
| Institut: | EXcorLab GmbH, R&D, Industriecenter Obernburg, D-63784 Obernburg | |
| Homepage: | www.excorlab.de |
Hemodialyseverfahren stellen momentan den Standard bei der Behandlung niereninsuffizienter Patienten der Klasse 5 dar. Die Elimination von Uremietoxinen im Rahmen der Hemodialyse erfolgt zurzeit sehr unspezifisch, d.h. ausschließlich über Größenausschluss durch Membranen, wobei Albumin (Mr: 69 kD) möglichst nicht entfernt werden soll. Welche der über 100 als Uremietoxine bekannten Moleküle besonders schädlich sind, ist jedoch nicht bekannt.
In diesem Teilvorhaben bestand das Ziel darin, kleine Plasmaproteine wie z.B. β2-Mikroglobulin (Mr=11.8 kD), Myoglobin (Mr=18 kD) und das retinolbindende Protein (Mr=23 kD) aus Hemofiltrat von Uremikern der Klasse 5 zu isolieren und daraufhin zu untersuchen, ob diese Proteine in vitro neutrophile Granulozyten aktivieren und damit zur Ent¬zündung und letztlich der Schädigung von Gefäßen führen können.
Mittels Ionenaustausch und Größenausschlusschromatographie wurden die Plasmaproteine isoliert. Aufregulation von Adhäsionsrezeptoren auf Neutrophilen und die Aktivierung der Neutrophilenfunktion („oxidative burst activity“) wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Untersuchung der Freisetzung von Myeloperoxidase (MPO), Elastase und Interleukin-1β (IL-1β) erfolgte mittels ELISA. Der Endothelzell-Aktivierungsassay erfolgte ebenfalls mittels Durchflusszytometrie (Aufregulation von VCAM) und ELISA (Freisetzung von IL-8). Die Zytotoxizitätsuntersuchungen der Plasmaproteine auf Endothel- und Muskelzellen erfolgte über die Messung der Fluoreszenz nach Inkubation der Zellen mit einem Vitalitätsfarbstoff.
Durch die aufgereinigten Proteine fand keine Aufregulation der Adhäsionsrezeptoren statt. Ein leichter „oxidativer burst“ war nach der Inkubation von Cystatin C, isoliert aus Hämofiltrat, zu verzeichnen. Die Freisetzung von Myeloperoxidase und Elastase spiegelte exakt die Ergebnisse des „oxidative burst“ wieder. Die Plasmaproteine führten zu einer leichten Proliferation von Endothel- und Muskelzellen.
Die aus Hemofiltrat isolierten Plasmaproteine hatten in allen biologischen Assays nur geringe Aktivität, d.h. nur geringe Toxizität. Sie stellen daher kein Target für verbesserte, spezifische, extrakorporale Eliminationsverfahren dar.
In diesem Teilvorhaben bestand das Ziel darin, kleine Plasmaproteine wie z.B. β2-Mikroglobulin (Mr=11.8 kD), Myoglobin (Mr=18 kD) und das retinolbindende Protein (Mr=23 kD) aus Hemofiltrat von Uremikern der Klasse 5 zu isolieren und daraufhin zu untersuchen, ob diese Proteine in vitro neutrophile Granulozyten aktivieren und damit zur Ent¬zündung und letztlich der Schädigung von Gefäßen führen können.
Mittels Ionenaustausch und Größenausschlusschromatographie wurden die Plasmaproteine isoliert. Aufregulation von Adhäsionsrezeptoren auf Neutrophilen und die Aktivierung der Neutrophilenfunktion („oxidative burst activity“) wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Untersuchung der Freisetzung von Myeloperoxidase (MPO), Elastase und Interleukin-1β (IL-1β) erfolgte mittels ELISA. Der Endothelzell-Aktivierungsassay erfolgte ebenfalls mittels Durchflusszytometrie (Aufregulation von VCAM) und ELISA (Freisetzung von IL-8). Die Zytotoxizitätsuntersuchungen der Plasmaproteine auf Endothel- und Muskelzellen erfolgte über die Messung der Fluoreszenz nach Inkubation der Zellen mit einem Vitalitätsfarbstoff.
Durch die aufgereinigten Proteine fand keine Aufregulation der Adhäsionsrezeptoren statt. Ein leichter „oxidativer burst“ war nach der Inkubation von Cystatin C, isoliert aus Hämofiltrat, zu verzeichnen. Die Freisetzung von Myeloperoxidase und Elastase spiegelte exakt die Ergebnisse des „oxidative burst“ wieder. Die Plasmaproteine führten zu einer leichten Proliferation von Endothel- und Muskelzellen.
Die aus Hemofiltrat isolierten Plasmaproteine hatten in allen biologischen Assays nur geringe Aktivität, d.h. nur geringe Toxizität. Sie stellen daher kein Target für verbesserte, spezifische, extrakorporale Eliminationsverfahren dar.
KTT
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