Erstellung und systematische Analyse von Protein-Protein Interaktionsnetzwerken

Leitung:		Prof. Dr. Erich Wanker
Institut:		Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Berlin-Buch
Homepage:		www.mdc-berlin.de

Protein-Tyrosine-Kinasen (PTKs) sind wichtige Regulatoren der intrazellulären Signaltransduktionswege deren Aktivität normalerweise einer strengen Kontrolle und Regulierung unterliegt. Die Beeinflussung der PTK-Signaltransduktion durch Mutationen oder andere genetische Veränderungen führt häufig zu einer deregulierten Kinaseaktivität und einer malignen Transformation der Zelle.
In Teilprojekt 6 sollte ein umfassendes Proteininteraktionsnetzwerk für die 32 humanen zytoplasmatischen PTKs und 27 ausgewählte Mutanom-Zielproteine sowie deren jeweilige mutierte Äquivalente erstellt werden. Darunter befanden sich Proteine wie PIK3CA, SMAD4 und PTEN.
Für das Interaktionsscreening wurde eine bereits etablierte Hochdurchsatz(HT)-Hefe-2-Hybrid(Y2H)-Methode verwendet.
Zunächst wurden dazu die bekannten cDNA-Klone aller humanen zytoplasmatischen PTKs in Gateway-kompatible Vektoren kloniert. Nach Validierung der Sequenzen wurden krebsrelevante Mutationen eingefügt. Die PTK-Klone und die anderen Mutanom-Zielproteine wurden nun mit Hilfe der Y2H-Technologie zusammen mit ihren Mutantenversionen gegen die 17000 humanen Proteine unserer Klonbibliothek getestet. Dabei konnten für die PTK-Klone und -Mutanten 7252, für die Mutanom-Zielproteine und –Mutanten 7997 Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) identifiziert werden.
Ein repräsentativer Anteil beider PPI-Sets konnte mittels des im Förderzeitraum als HT-Methode etablierten LUMIER-Assays, ein weiterer Teil der Mutanom-Zielprotein-PPIs zusätzlich durch HT-FRET-Methoden (Abb. 1) erfolgreich validiert werden.
Die generierten PPI-Daten wurden mit bioinformatischen Methoden analysiert, bewertet und dazu genutzt, potentielle Modulatoren krebsbezogener Signaltransduktionswege in zellbasierten Reporterexperimenten, wie RNAi-knock-down-Assays und Überexpressionsstudien, systematisch zu identifizieren.
Durch die Arbeiten wurde eine wertvolle wissenschaftliche Ressource geschaffen, um neue Tumorsuppressoren, Onkogene und Interaktionspartner bekannter Krebszielproteine zu identifizieren und weiter zu untersuchen. Außerdem tragen die Forschungsergebnisse zur Aufklärung neuer onkogener Kinase-Signaltransduktionswege und zur Entwicklung neuer Ansatzpunkte für die Krebs-Medikamentenentwicklung bei.