NGFN-PLUS
Erstellung von Genexpressionssignaturen von neurodegenerative Krankheitsprozessen
| Leitung: | Dr. Wilfried Nietfeld | |
| Institut: | Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin | |
| Homepage: | www.molgen.mpg.de/research/lehrach/ |
Ein wesentliches Merkmal neurodegenerativer Erkrankungen (NDs) ist die Akkumulation oder Aggregation fehlgefalteter Proteine, die im Verdacht steht zum Absterben der Nervenzellen in verschiedenen Gehirnregionen zu führen. Durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen oder chemischer Substanzen kann die Genexpression und damit die Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen beeinflusst werden.
In diesem Teilprojekt haben wir ein zelllinienbasiertes In-vivo-Modell der Aggregation entwickelt, in dem acht bekannte, krankheitsrelevante Proteine und deren Mutanten überexprimiert wurden: Parkinson Protein 2, Präsenilin 1, Ataxin 1, das Amyloid-Präkursor-Protein; Superoxiddismutase 1, Alpha-Synuclein, Huntingtin und TDP-43. Diese Proteine werden als ursächlich für die folgenden neurodegenerativer Erkrankungen betrachtet: Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, amyotrophe Lateralsklerose (ALS), spinozerebelläre Ataxie und Chorea Huntington. Diese Zelllinien wurden charakterisiert und dem Teilprojekt 7 zur Durchführung verschiedener Zellassays zur Verfügung gestellt.
Für Genexpressionsanalysen wurden zunächst Zelllinien, die Wildtyp- und mutiertes Huntingtin exprimieren, verwendet. Die Zellen wurden mit 37 verschiedenen chemischen Wirkstoffen inkubiert, um herauszufinden, ob diese im zellulären System in der Lage sind die Proteinaggregation von Huntingtin zu beeinflussen. Die Auswahl der Wirkstoffe erfolgte aufgrund von Vorergebnissen, die eine Wirkung auf Huntingtin vermuten ließen.
Nach der Genexpressionsanalyse mittels BeadChips (Abb1.), erfolgte die Datenauswertung und Erstellung einer "connectivity map", also einer Karte der Zusammenhänge zwischen den Wirkstoffen und einer Veränderung in der Genexpression. Es konnten drei Substanzen identifiziert und validiert werden, die eine Wirkung auf die Fehlfaltung und Aggregation von Huntingtin haben könnten.
Zur Erhöhung des Durchsatzes im Wirkstoff-Screening wurde ein sogenannter FRET-Assay etabliert. Dies ist ein hochsensitives Testverfahren, das auf Fluoreszenzmessung basiert. Dieser Assay konnte innerhalb des Verbundes auch zur Validierung von Protein-Protein-Interaktionen genutzt werden, die für die genannten krankheitsrelevanten Proteine in groß angelegten, automatisierten Screenings erhoben wurden.
Darüber hinaus haben wir in Zusammenarbeit mit den Teilprojekten 4 und 8 mittels RNA-Sequenzierung Genexpressionsanalysen aus Blut von Huntington-Patienten und Kontrollpersonen durchgeführt. Weiterhin wurden im Projektverlauf Genexpressionsanalysen von Alzheimer-Mausmodellen erstellt, welche mit verschiedenen Wirkstoffen behandelt wurden. Für einzelne Substanzen konnte ein Einfluss auf die Genexpression im Mausgehirn nachgewiesen werden. Sie wurden in weiteren Tests auf ihre Eignung für therapeutische Zwecke untersucht. Dazu zählten verhaltensbiologische Tests, die eine verbesserte Gedächtnisleistung nachwiesen.
Abb. 1: Experimentelle Strategie zur Durchführung von Genexpressionsanalysen im Teilprojekt.
Weitere Teilprojektleiter:
In diesem Teilprojekt haben wir ein zelllinienbasiertes In-vivo-Modell der Aggregation entwickelt, in dem acht bekannte, krankheitsrelevante Proteine und deren Mutanten überexprimiert wurden: Parkinson Protein 2, Präsenilin 1, Ataxin 1, das Amyloid-Präkursor-Protein; Superoxiddismutase 1, Alpha-Synuclein, Huntingtin und TDP-43. Diese Proteine werden als ursächlich für die folgenden neurodegenerativer Erkrankungen betrachtet: Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, amyotrophe Lateralsklerose (ALS), spinozerebelläre Ataxie und Chorea Huntington. Diese Zelllinien wurden charakterisiert und dem Teilprojekt 7 zur Durchführung verschiedener Zellassays zur Verfügung gestellt.
Für Genexpressionsanalysen wurden zunächst Zelllinien, die Wildtyp- und mutiertes Huntingtin exprimieren, verwendet. Die Zellen wurden mit 37 verschiedenen chemischen Wirkstoffen inkubiert, um herauszufinden, ob diese im zellulären System in der Lage sind die Proteinaggregation von Huntingtin zu beeinflussen. Die Auswahl der Wirkstoffe erfolgte aufgrund von Vorergebnissen, die eine Wirkung auf Huntingtin vermuten ließen.
Nach der Genexpressionsanalyse mittels BeadChips (Abb1.), erfolgte die Datenauswertung und Erstellung einer "connectivity map", also einer Karte der Zusammenhänge zwischen den Wirkstoffen und einer Veränderung in der Genexpression. Es konnten drei Substanzen identifiziert und validiert werden, die eine Wirkung auf die Fehlfaltung und Aggregation von Huntingtin haben könnten.
Zur Erhöhung des Durchsatzes im Wirkstoff-Screening wurde ein sogenannter FRET-Assay etabliert. Dies ist ein hochsensitives Testverfahren, das auf Fluoreszenzmessung basiert. Dieser Assay konnte innerhalb des Verbundes auch zur Validierung von Protein-Protein-Interaktionen genutzt werden, die für die genannten krankheitsrelevanten Proteine in groß angelegten, automatisierten Screenings erhoben wurden.
Darüber hinaus haben wir in Zusammenarbeit mit den Teilprojekten 4 und 8 mittels RNA-Sequenzierung Genexpressionsanalysen aus Blut von Huntington-Patienten und Kontrollpersonen durchgeführt. Weiterhin wurden im Projektverlauf Genexpressionsanalysen von Alzheimer-Mausmodellen erstellt, welche mit verschiedenen Wirkstoffen behandelt wurden. Für einzelne Substanzen konnte ein Einfluss auf die Genexpression im Mausgehirn nachgewiesen werden. Sie wurden in weiteren Tests auf ihre Eignung für therapeutische Zwecke untersucht. Dazu zählten verhaltensbiologische Tests, die eine verbesserte Gedächtnisleistung nachwiesen.
Abb. 1: Experimentelle Strategie zur Durchführung von Genexpressionsanalysen im Teilprojekt.
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